隨著農(nóng)村畜禽養(yǎng)殖業(yè)從個(gè)體散養(yǎng)走向集約化養(yǎng)殖, 畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生的廢物已經(jīng)成為我國農(nóng)村環(huán)境污染的主要來源之一.集約化豬場每百頭豬每天產(chǎn)生的廢水可高達(dá)2~3 m3.據(jù)統(tǒng)計(jì), 2002年我國畜禽糞便產(chǎn)生量達(dá)27.5億t, 畜禽糞便每年流失至水體的總氮和總磷分別為87萬t和34.5萬t.規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場產(chǎn)生的污水通常采用沼氣池厭氧發(fā)酵處理, 以求資源化利用發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣.但與此同時(shí)產(chǎn)生的大量沼液中仍然含有高濃度的氮、磷等營養(yǎng)鹽.經(jīng)過沼氣池發(fā)酵處理的豬場沼液具有兩大特點(diǎn)：一是氨氮濃度高且是污水中的主要氮源;二是污水中氮、磷濃度差異大.經(jīng)對(duì)豬場沼液的周年監(jiān)測, 發(fā)現(xiàn)原始沼液中總氮濃度可高達(dá)800 mg·L-1, 氨氮濃度超過700 mg·L-1, 總磷超過3 mg·L-1.將其直接排放到水體中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化, 破壞水域生態(tài)系統(tǒng)平衡.在2014年的《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》頒發(fā)及人們對(duì)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量要求提升的大背景下, 的畜禽糞污無害化處理技術(shù)對(duì)實(shí)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明具有重要的意義, 尋找的沼液綜合利用技術(shù)和沼液無害化處理技術(shù)顯得尤為急迫.

微藻細(xì)胞能以光為能源, 從水體中吸收硝態(tài)氮、氨態(tài)氮及磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞, 從而降低水體中的氮磷營養(yǎng)鹽.同時(shí), 生成的微藻細(xì)胞又可用于飼料、新能源生產(chǎn)等多種用途.因此, 微藻作為畜禽養(yǎng)殖污水的生物處理及資源化利用的載體近來備受關(guān)注.已有研究表明, 利用污水中的氮磷等營養(yǎng)鹽培養(yǎng)微藻, 能有效去除污水中的氮磷營養(yǎng)鹽, 實(shí)現(xiàn)環(huán)境保護(hù)及資源的循環(huán)利用.Wang等(2010)將小球藻(Chlorella sp.)接種到厭氧分解后的牛糞污水中, 經(jīng)21 d可去除76%~83%的總氮和63%~75%的總磷.Zhang等(2008)發(fā)現(xiàn), 固定化柵藻(Scenedesmus sp.)對(duì)污水中氮磷的去除率zui高達(dá)99%.劉林林等(2014)發(fā)現(xiàn), 狹形小樁藻(Characium angustum)SHOU-F87在豬場養(yǎng)殖污水中可以去除64%的總氮和96%的總磷.不同微藻對(duì)水體中的氮磷等營養(yǎng)鹽的耐受、吸收和利用能力不同(劉林林等, 2014).當(dāng)營養(yǎng)鹽水平足以滿足浮游植物生長時(shí), 浮游植物對(duì)氮磷的吸收基本按照Redfield比例(N:P=16:1) 進(jìn)行(Redfield, 1958).而豬場養(yǎng)殖污水經(jīng)厭氧發(fā)酵后形成的沼液中, 氮磷濃度極度不平衡, 尤其是氨態(tài)氮濃度高, 而總磷濃度低.*的氮磷比遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離藻類生長的正常需求, 不符合微藻的zui適生長條件.盡管利用微藻凈化污水的研究已有大量報(bào)道, 但在污水中補(bǔ)充限制性磷鹽以提高微藻生長及營養(yǎng)鹽的吸收效率的研究尚少.本試驗(yàn)所用綠球藻(Chlorococcum sp.)是一株從豬場養(yǎng)殖污水中分離出的藻株, 對(duì)污水環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng).穆亮亮等(2016)研究發(fā)現(xiàn), 此株綠球藻具有耐高溫的特性, 在培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí), 藻細(xì)胞密度和油脂含量zui高, 且可以耐受40 ℃高溫.

因此, 本文通過研究該株綠球藻在添加不同濃度磷的污水中生長及凈化污水的特點(diǎn), 以期尋找到綠球藻在污水中生長較好且去除氮、磷效率較高的zui適氮磷比.

2 材料和方法(Materials and methods)2.1 試驗(yàn)材料2.1.1 藻種來源

試驗(yàn)藻株分離自浙江嘉興余新鎮(zhèn)敦好農(nóng)牧有限公司露天沼液存貯池, 在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行純化并逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后用于本試驗(yàn), 該藻種經(jīng)顯微鏡鑒定為綠球藻屬(Chlorococcum sp.).

2.1.2 試驗(yàn)污水

試驗(yàn)用沼液取自上海市光明集團(tuán)明錦畜牧有限公司的養(yǎng)豬場, 沼液經(jīng)沉淀處理后, 再經(jīng)500目篩網(wǎng)過濾, 并用自來水稀釋至氨氮濃度約為300 mg·L-1后用于本試驗(yàn).

2.2 試驗(yàn)方法

在氨氮濃度約為300 mg·L-1的污水中, 添加不同量的NaH2PO4以調(diào)節(jié)污水N:P配制成可溶性氮、磷物質(zhì)的量濃度比分別為8:1、16:1、32:1和64:1的系列污水, 以不添加NaH2PO4的原污水作為對(duì)照組(N:P比約為532:1).各組水質(zhì)指標(biāo)如表 1所示.將預(yù)先擴(kuò)大培養(yǎng)的綠球藻離心收集藻細(xì)胞, 然后將收集的藻細(xì)胞分別接種到裝有1000 mL不同氮磷比污水的錐形瓶中, 初始接種密度為400×104 cells·mL-1, 每組設(shè)置3個(gè)平行.將綠球藻置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 溫度35 ℃, 光照3000 lx, 光照周期為24 L:0 D(24 h光照, 0 h黑暗).每天定時(shí)搖瓶3次, 隔天用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度, 每隔2 d測定培養(yǎng)水體中氮、磷變化情況.試驗(yàn)進(jìn)行12 d, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集藻細(xì)胞測量生物量干重.

表 1 試驗(yàn)用污水的水質(zhì)指標(biāo)狀況

2.3 指標(biāo)檢測

采用血球計(jì)數(shù)板測定藻細(xì)胞密度, 并采用式(1) 計(jì)算相對(duì)生長率K(成永旭, 2005).

(1)
式中, N0為培養(yǎng)初始藻細(xì)胞密度(cells·mL-1), Nt為培養(yǎng)t天后的藻細(xì)胞密度(cells·mL-1), t為培養(yǎng)時(shí)間(d).

培養(yǎng)水體經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾后進(jìn)行檢測, 參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》(, 2002)測定水樣中氮、磷水平.其中, 氨態(tài)氮測定采用納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮測定采用紫外分光光度法;總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法;總磷測定采用鉬酸銨分光光度法.

氮、磷去除率r的計(jì)算見式(2)(劉林林等, 2014).

(2)
式中, C0和Ct分別為初始氮、磷的濃度和培養(yǎng)t天后的濃度(mg·L-1).

培養(yǎng)結(jié)束后, 每組取80 mL藻液經(jīng)預(yù)先恒重過的0.45 μm微孔濾膜抽濾, 將濾膜置于鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘至恒重, 計(jì)算生物量干重B (穆亮亮, 2016)：

(3)
式中, W0為預(yù)恒重過的0.45 μm微孔濾膜的質(zhì)量(g), W1為恒重過后0.45 μm微孔濾膜+藻泥的總質(zhì)量(g), V為抽濾的藻液體積(L).

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較, 以 p<0.05表示差異顯著.

3 結(jié)果(Results)3.1 綠球藻在不同氮磷比污水中的生長狀況

不同氮磷比污水中綠球藻生長曲線如圖 1所示.由圖可知, 前6 d為指數(shù)生, 之后各組藻細(xì)胞密度趨于平緩后開始下降.在培養(yǎng)8 d后, N:P為8:1、16:1、32:1、64:1處理組和對(duì)照組藻的相對(duì)生長率分別為0.248、0.256、0.261、0.279和0.244.N:P為64:1組的綠球藻生長, 在第8 d時(shí)藻細(xì)胞密度zui高為3646×104 cells·mL-1, 第12 d時(shí)細(xì)胞密度為3393×104 cells·mL-1, 均顯著高于其他組(p < 0.05);其次為32:1和16:1組, 對(duì)照組的細(xì)胞密度zui低.

圖 1綠球藻在不同氮磷比污水中的生長曲線

培養(yǎng)12 d后, 不同氮磷比污水中綠球藻的生物量干重如圖 2所示, N:P=64:1組藻生物量(以干重計(jì))zui高(0.49 g·L-1), 其次為32:1和16:1組, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).

圖 2綠球藻在不同氮磷比污水中的生物量(不同小寫字母表示不同實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著差異(p<0.05))

3.2 不同氮磷比對(duì)綠球藻去除污水氨態(tài)氮的影響

培養(yǎng)12 d后, 各處理組的綠球藻對(duì)豬場污水的氨態(tài)氮去除率均較高, 達(dá)70%以上(圖 3).N:P為64:1組對(duì)氨態(tài)氮的去除率達(dá)到zui高, 為74.94%, 氨態(tài)氮濃度從291.31 mg·L-1降低至73.01 mg·L-1;其次是32:1、16:1和8:1組, 去除率分別為73.71%、73.40%和71.44%, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組對(duì)氨態(tài)氮的去除率zui低(68.79%), 氨態(tài)氮濃度從291.31 mg·L-1降低至90.91 mg·L-1.

圖 3不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除氨態(tài)氮的影響

3.3 不同氮磷比對(duì)污水中硝態(tài)氮濃度的影響

培養(yǎng)過程中, 各處理組水體中的硝態(tài)氮濃度呈升高趨勢(圖 4).培養(yǎng)12 d后, N:P為64:1組的硝態(tài)氮濃度zui高, 從13.31 mg·L-1增加至48.66 mg·L-1, 其次是32:1和16:1組, 均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組硝態(tài)氮增加量zui低, 從13.31 mg·L-1增加至38.21 mg·L-1.

圖 4不同氮磷比對(duì)污水中硝態(tài)氮濃度的影響

3.4 不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總氮的影響

由圖 5可知, 初始水體中總氮濃度為290.84 mg·L-1, 試驗(yàn)結(jié)束時(shí), N:P為64:1組的總氮去除率zui高, 水體中總氮濃度降低至148.96 mg·L-1, 總氮去除率為48.8%.其次為32:1和16:1組, 且三者之間無顯著差異(p>0.05), 但均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05).對(duì)照組的總氮去除率zui低, 為42.71%, 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)水體中總氮濃度為166.61 mg·L-1.

圖 5不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總氮的影響

3.5 不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總磷的影響

不同處理組水體中總磷濃度的變化如圖 6所示, 各處理組的總磷去除率隨N:P增大而增大.總磷去除率zui高的為對(duì)照組, 達(dá)到82.74%, 其次為64:1組, 去除率為71.86%.試驗(yàn)結(jié)束時(shí), N:P為64:1和對(duì)照組污水中總磷濃度分別為3.07和0.22 mg·L-1.N:P為8:1組的總磷去除率zui低, 僅為33.62%.

圖 6不同氮磷比污水對(duì)綠球藻去除總磷的影響

4 討論(Discussion)

氮是微藻生長過程中一種重要的營養(yǎng)素, 主要用于合成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及其他具有生理活性的含氮化合物.微藻可以利用多種形式的氮源, 但微藻生長狀態(tài)與氮源的形式和數(shù)量有密切.通常情況下綠藻類會(huì)優(yōu)先利用氨態(tài)氮, 直到耗盡后才開始利用硝態(tài)氮.因此, 選擇綠藻門的微藻可以較好地適應(yīng)畜禽養(yǎng)殖污水的特點(diǎn), 利用氨態(tài)氮作為其生長的氮源, 從而達(dá)到凈化污水的目的.然而, 高濃度的氨氮對(duì)微藻生長具有抑制作用, 微藻能夠耐受的氨態(tài)氮濃度隨著藻種的不同存在差異.本試驗(yàn)采用的綠球藻, 正是一株從豬場污水中篩選出的綠藻藻株, 相比天然水體中分離的微藻, 其對(duì)高氨氮污水的適應(yīng)性更強(qiáng).

磷是微藻合成磷脂、核酸、核苷酸等物質(zhì)的重要元素, 是微藻生長必需的基本營養(yǎng)素.微藻對(duì)磷的吸收有2種用途, 一是合成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì), 如磷脂等;另一種被稱為“消費(fèi)”(luxury uptake), 即微藻吸收過量的磷并以無機(jī)多磷酸鹽形式貯存，當(dāng)外界磷濃度受限制時(shí), 藻細(xì)胞內(nèi)貯存的磷酸鹽則可被利用.因此, 當(dāng)微藻進(jìn)入在一個(gè)相對(duì)缺磷的培養(yǎng)體系中, 微藻仍然可以利用先前貯存的磷源實(shí)現(xiàn)一定的生長.

本研究中, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的條件下, 無論是否添加磷源, 各組污水中的綠球藻都表現(xiàn)出良好的生長性能, 其中, N:P為64:1組在第8 d時(shí)具有zui大的細(xì)胞密度, 從zui初的400×104 cells·mL-1上升到3646×104 cells·mL-1, 相對(duì)生長率達(dá)0.279, 12 d時(shí)生物量達(dá)0.49 g·L-1.劉林林等(2014)研究了狹形小樁藻在豬場污水中的生長性能, 其zui高相對(duì)生長率為0.120.嚴(yán)佳琪等(2012)研究了5種淡水微藻在f/2培養(yǎng)基條件下的生長性能, 其中, 綠球藻SHOU-F3的zui高相對(duì)生長率K為0.21.對(duì)比上述研究與本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 本研究所用綠球藻在豬場沼液中的相對(duì)生長率較高, 表明此株綠球藻在高氨氮濃度污水中生長較好, 且污水的N:P比值對(duì)耐污綠球藻的生長產(chǎn)生了顯著影響.培養(yǎng)液中N:P影響微藻生長已在多種微藻中得到證實(shí).劉皓等(2010)用不同氮磷比培養(yǎng)液培養(yǎng)中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), N:P為64:1組的生長率和細(xì)胞數(shù)量zui高.Rhee(1978)發(fā)現(xiàn), 柵藻(Scenedesmus sp.)在不受任何營養(yǎng)物質(zhì)限制的情況下, 所需N:P為30:1.Li等(2010)報(bào)道了柵藻(Scenedesmus sp.)的zui適氮磷比是5:1~8:1.Kim等(2013)認(rèn)為微藻生長zui適的氮磷比取決于氮源種類.盡管Stumn提出藻類的“經(jīng)驗(yàn)分子式”為C106H181O45N16P, 但藻細(xì)胞組成會(huì)受藻種不同及培養(yǎng)條件等因素影響, 不同藻種代謝途徑有差異, 因此, 16:1并不是所有藻株zui適的氮磷比(Arbib et al., 2013).本研究中, 綠球藻在污水中生長的zui適氮磷比為64:1, 也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Redfield比值(N:P=16:1).這可能與該藻株分離自豬場污水有關(guān).豬場污水中氮相對(duì)于磷顯著偏高, 推測該株綠球藻已經(jīng)適應(yīng)了在高氨氮濃度及高氮磷比條件并生長存活.這也進(jìn)一步暗示通過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)馴化, 可以提升微藻適應(yīng)高氨氮濃度及高氮磷比的能力.

培養(yǎng)液氮磷比值不但影響綠球藻的生長, 還影響綠球藻對(duì)污水中氮、磷的吸收凈化效果.本研究發(fā)現(xiàn), N:P約為532:1的原污水中綠球藻生長和去除氮效果zui差, 添加NaH2PO4調(diào)整N:P后, 各組綠球藻的生長和去除氮效果均有改善.綠球藻在N:P為64:1的污水中生長, 且對(duì)氨態(tài)氮、總氮去除率高達(dá)74.94%和48.78%, 氨氮的濃度降至73.01 mg·L-1, 基本達(dá)到集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)水污染物zui高允許日均排放濃度限定的70 mg·L-1 (浙江省等, 2005).說明在豬場養(yǎng)殖污水中磷不足條件下, 綠球藻對(duì)氮的吸收受到限制, 補(bǔ)充磷源后, 綠球藻的細(xì)胞密度和對(duì)氮的去除效果明顯提高.Martineza等(2014)也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)微藻的無磷培養(yǎng)液中添加磷源后, 藻細(xì)胞內(nèi)磷濃度和培養(yǎng)液中氨態(tài)氮的去除率顯著增加.Wang和Lan(2011)發(fā)現(xiàn), 富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)對(duì)污水中氮的去除受N:P影響顯著, 而磷的去除對(duì)N:P不敏感.Beuckels等(2015)的研究結(jié)果表明, 氮濃度對(duì)磷的去除率有積極影響, 磷的去除需要高濃度的氮.這為以后提高豬場養(yǎng)殖污水中氮的去除效率提供了有力依據(jù).

對(duì)照污水中綠球藻的生長曲線和污水中氨態(tài)氮、總氮和硝態(tài)氮的去除曲線, 可以發(fā)現(xiàn), 在綠球藻快速生長的前6 d, 污水中的氨態(tài)氮也呈快速下降的趨勢, 且各組間的氨態(tài)氮去除率隨微藻的相對(duì)生長率增大而增大, 表明微藻的快速生長是引起污水中氮、磷濃度下降的主要原因.然而, 在此期間, 硝態(tài)氮沒有被利用, 反而濃度略升高.一方面, 可能是豬場養(yǎng)殖污水中存在硝化細(xì)菌, 硝化細(xì)菌將部分氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮所致.另一方面, 也可能是微藻快速生長過程中光合作用產(chǎn)生的氧, 加速了部分氨態(tài)氮氧化成硝態(tài)氮所致.培養(yǎng)期間, 藻細(xì)胞生長的同時(shí), 氨態(tài)氮、總氮和總磷濃度下降而硝態(tài)氮濃度上升的現(xiàn)象也證明了該株綠球藻優(yōu)先利用氨態(tài)氮的特點(diǎn).

然而, 對(duì)照污水中綠球藻的生長曲線和污水中總磷的吸收曲線, 盡管在綠球藻快速生長的前6 d, 污水中的總磷也呈快速下降的趨勢, 但各組總磷的去除率并不與各組綠球藻的相對(duì)生長率存在正相關(guān), 初始總磷水平越低, 總磷的去除率越高.N:P為8:1組的初始磷濃度zui高(87.62 mg·L-1), 前6 d對(duì)磷的去除率為30.08%, 而對(duì)照組初始磷濃度zui低(1.27 mg·L-1), 前6 d的磷去除率高達(dá)82.74%, 但高磷水平組總磷的去除量更高, 此結(jié)果也證明了微藻對(duì)磷的“消費(fèi)”現(xiàn)象.N:P為64:1組在綠球藻培養(yǎng)12 d時(shí)的總磷去除率達(dá)71.86%, 總磷濃度降低為3.07 mg·L-1, 低于集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)水總磷zui高允許日均排放濃度限定的7 mg·L-1 (浙江省等, 2005).然而, 通過添加磷源以提高微藻對(duì)豬場廢水的凈化效率會(huì)增加處理成本, 從現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的角度, 還需考慮其性能.

5 結(jié)論(Conclusions)

污水中氮磷比值影響綠球藻生長及其對(duì)污水中氮、磷的凈化效果, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的豬場養(yǎng)殖污水中, 通過添加NaH2PO4以調(diào)節(jié)污水N:P為64:1, 接種綠球藻(Chlorococcum sp.)培養(yǎng)12 d后, 可使污水中的氨態(tài)氮和總磷分別降低到73.01 mg·L-1和3.07 mg·L-1, 基本達(dá)到相關(guān)排放標(biāo)準(zhǔn).